2020年12月9日，PCCP（phys.chem.chem.phys）期刊發表文章《DOPC versus DOPE as a helper lipid for gene-therapies: molecular dynamics simulations with DLin-MC3-DMA》^[1]。該文章使用分子模擬手段分析使用同一種陽離子脂質DLin-MC3-DMA與兩種不同的輔助磷脂（DOPC和DOPE）構建兩種脂質體體系進行模擬。分析兩種合成磷脂形成的脂質體差異。為將來理性化設計脂質體提供可行性。

摘要：

可電離陽離子脂質是基因治療遞送系統脂質納米顆粒 (LNP) 的重要組成成分。 DLin-MC3-DMA 是有前途的可電離陽離子脂質（或胺脂質）之一。根據它們在藥物中的應用，在包裹核酸的LNP中還包含各種輔助脂質，例如磷酸化和聚乙二醇化脂質、膽醇等。由于其復雜的成分，這些基因療法中應用的LNP結構改進較為困難，并且尚未確定每種脂質在LNP的藥理作用。在這項工作中，構建了DLin-MC3-DMA中性形式的原子模型，并進行了全原子模型行下的分子動力學 (MD) 模擬，以研究LNP中合成磷脂頭部基團對細胞膜可能存在的影響。在中性條件下（ pH = 7.4）構建并模擬了含有兩種不同摩爾比的 DLin-MC3-DMA（5%和15%）的DOPC及DOPE 脂質的雙層。MD軌跡分析結果顯示DOPE脂質頭部基團與DLin-MC3-DMA尾部密切相關，而DOPC脂質的頭部基團未觀察到這種顯著關聯。此外，DOPE和DLin-MC3-DMA之間較強的聯系導致DLin-MC3-DMA固定在膜表面。脂質之間的相互作用減慢了兩個雙層膜體系的橫向擴散，其中在含有DOPE的體系中觀察到擴散速率的降低更為顯著。這也解釋利用磷脂酰乙醇胺構建的脂質體雙層膜（DOPE/DLin-MC3-DMA）具有較低的水滲透性，并且可能與其較差的轉染特性有關。

圖1：分子動力學模擬的脂質. (a) DLin-MC3-DMA. (b) 構建DLin-MC3-DMA力場參數的部分. (c) DOPC,18:1 (Δ9 – cis) PC. (d) DOPE, 18:1(Δ9 – cis) PE.

模擬方法：

1. DLin-MC3-DMA模型的參數化

DLin-MC3-DMA模型參數的構建參考了多不飽和磷脂相同的原理，由于LNP周圍的環境通常為中性，因此設置總電荷為零以模擬中性條件下的可電離陽離子脂質的模型，MD模擬過程中并不會用到該化合物的電離狀態。

參考已有的用于多不飽和磷酸酯的SLipids力場（FF）推導DLin-MC3-DMA的力場參數。SLipids FF的一般形式為：

E_FF = E_bonded + E_non-bonded

E_bonded = E_angles + E_dihedrals + E_bonds + E_{Urey–Bradley}

E_non-bonded = E_{Lennard-Jones} + E_Coulomb

本研究中，重點是計算陽離子脂質的頭部基團的電荷以及二面體參數，而脂質尾部的二面體參數可以直接調用SLipids FF中已知的不飽和脂質中的參數，脂質尾部的電荷參考已有電荷進行略微調整即可。

由于DLin-MC3-DMA的全原子量化計算所需的時間較長，計算機內存要求較高，為了便于計算，使用高斯gaussian09軟件，利用B3LYP方法，CC-pVTZ基組以及RESP靜電勢約束方法對DLin-MC3-DMA的等效小模型（圖1b）進行了電荷計算。在IEFPCM模型中，脂質體的頭部基團被放置在介電常數為78.4的可極化連續體系中，模擬溶劑效應以及對電荷分布的誘導極化。具體電荷參數可在support文件中查閱。

在計算出部分原子電荷后，參考之前的SLipids FF相同的原理推導出新的二面體參數。二面角參數可以在support文件圖S2中查閱。與多不飽和脂質的力場參數一樣，原始分子使用二階Møller–Plesset擾動原理以及CC-pVDZ基組進行優化，在-180度到180度的區間里，設置10度為步長，保持其他自由度不變，通過圍繞二面角旋轉優化分子。為了計算不同角度的構象下的相對量子力學能量，采取了相互作用能的混合方法（HM-IE），關系是為：

E_CCSD(T)/BBS = E_CCSD(T)/SBS + E_CCSD(T)/BBS − E_CCSD(T)(SBS) ≈ E_CCSD(T)/SBS + E_MP2/BBS − E_MP2/SBS

其中MP2表示二階Møller–Plesset擾動原理，CCSD（T）是耦合簇理論中的耦合簇單雙和微擾三激發方法。SBS表示小基組（cc-pVDZ）,BBS表示大基組（cc-pVQZ）。

完成高階量子化學計算后，所得值可以利用如下方程擬合二面體勢：

E_dihedral = (E_CCSD(T)/BBS − E_MD) − (E_CCSD(T)/BBS − E_MD)_min

這里的EMD表示勢能的值，利用MD軟件，設置二面角的參數設置為0時可以得到EMD的值。二面體擬合的極限約為 2 kJ/mol。此外，新計算得到的二面體勢能用于新型陽離子脂質，并在其力場文件中新增CTL6、NL和CL2原子類型。其他 FF 參數，例如鍵的參數、二面角的缺失值以及Urey-Bradley和角度參數均取自SLipids FF和CHARMM36 FF中已有的原子類型（CTL5、NH3L 和 CTL2）

2. 分子模擬參數設置

模擬體系詳見表一，首先，構建了兩種脂質雙分子層，一種*由DOPC組成，一種*由DOPE構成。每個雙層膜都由100個包含兩個磷脂的膜單體組成，一個處于直立，一個處于倒立（非鏡像對稱）。構建好的兩種雙層膜用于構建不同含量的DLin-MC3-DMA的膜，在選定好的位置（距離10A）的磷脂雙層膜中，刪除磷脂，插入優化后的DLin-MC3-DMA分子代替。

表1 模擬體系組分

每個創建好的模擬系統在NPT系綜下平衡 300 ns，然后再平衡模擬300 ns。模擬體系采用 1個標準大氣壓的壓力并且使用Berendsen恒壓器進行壓力耦合，溫度設置恒定，保持在 298 K。算法采用牛頓運動方程式，設置步長為 2 fs 的leap-frog，采用截斷半徑為1.2nm的范德華式Verlet截斷方案。鍵長使用 LINCS 算法進行 12 次迭代限制。MD模擬和所得軌跡的分析是使用gromacs-4.6.7軟件完成的。

3. 動力學模擬優化設置

對DLin-MC3-DMA的4個體系進行經典的MD平衡模擬，確定能量最小化，體系達到穩定。對于每個脂質雙層，創建了5種不同的模擬起始條件。這些設置用于對每個脂質雙層進行 5 次平行的動力學模擬。

廣義坐標值 (CV) 被選為水分子質心與脂質雙層之間距離（見圖 2）。 高斯函數的高度為 1.2 kJ mol−1。 它們的寬度為 0.05 nm（參數 σ），每 500 步（參數 PACE 的值）沉積一次。 由于水分子的小尺寸，偏差因子γ被設置為10.0。

圖2 初始動力學模擬的廣義坐標。 紅色小分子是水分子，青色分子是脂質。 為清楚起見，省略了所有其他水分子。 “CV”是坐標值，“PMF”是自由能勢能面。

所有模擬都是在NVT系綜中，恒溫298K下，使用V-rescale熱浴進行。牛頓運動方程的積分器是跳躍式的，采用時間步長為 2 fs 和Verlet截斷方案，其中截止半徑為 1.2 nm。 LINCS 算法被用于約束 12 次迭代的鍵長。 用作MD模擬的軟件是 gromacs-4.6.7，用于自由能計算的 plumed-2.1.262。 每次模擬進行150 ns。

結果與討論

圖3：系統截取的一幀快照：正面視圖和體系頂部的視圖。(a) DOPC和5%的DLin-MC3-DMA (b) DOPE和5%的DLin-MC3-DMA，(c) DOPC 和 15% 的 DLin-MC3-DMA 和 (d) DOPE 和 15% DLin-MC3-DMA。磷脂以青色顯示，磷以深石灰色球體顯示。DLin-MC3-DMA 以深藍色顯示。圖片采用VMD軟件繪制

在（a）和（b）中，分別在 DOPC 和 DOPE 膜中 DLin-MC3-DMA 的定位沒有觀察到顯著差異：DLin-MC3-DMA均位于靠近雙層膜表面的位置。 圖 3(c) 和 (d) 展示了磷脂含量較低的體系中，DLin-MC3-DMA 表現出偏好位于具有 DOPE 的膜表面，而在 DOPC 的情況下，DLin-MC3-DMA在很大程度上分布在雙層的中心。

表2 脂質體中各組分的橫向擴散速度（10^-7cm²s^-1）

在含有DOPC的系統中，當DLin-MC3-DMA的量增加時，DOPC的擴散以及DLin-MC3-DMA的擴散都會減慢。 在含有 DOPE 的系統中，添加DLin-MC3-DMA比含有 DOPC的膜更顯著地降低了兩種脂質的擴散。 這可以被認為是含有 DLin-MC3-DMA 和 DOPE的 LNP 在質粒 DNA 遞送中沒有表現出高轉染效率的原因，因為在DNA遞送過程中，橫向擴散和膜融合是重要的因素。

表3 脂質體大小以及膜厚度

根據該表，含有DOPC的膜比含有DOPE的膜具有更高的脂質體面積。 隨著DLin-MC3-DMA摩爾比的增加，每個脂質的平均面積也會增加。 在使用DOPE的體系中，與純膜相比，每個脂質的平均面積增長高于使用DOPC的系統。 然而，表3中的值對于每個脂質頭部基團并不精確，因為DLin-MC3-DMA的脂質尾部可能出現在表面，并且在某些幀中，整個陽離子脂質可能位于膜的中心，而不出現在雙層表面。 可以從每個脂質的面積值得出的結論是，模擬框在DLin-MC3-DMA摩爾比為15 %時變得更寬。

圖4. 質量密度分布圖：(a) DOPC 和 (b) DOPE。 “Pure”代表僅含有磷脂的脂質雙層，+5% DLin-MC3-DMA 意味著它是5%的MC3，+15% DLin-MC3-DMA 意味著它是 15% 的MC3.

圖4展示了模擬系統以及含有純磷脂的脂質雙層的質量密度分布。 隨著 DLin-MC3-DMA 濃度的增加，圖中 (a) 和 (b) 部分都表現出相同的質量密度峰值向雙層中心移動的趨勢。 這可以解釋為雙層變薄，因為質量密度的最高值與脂質頭部集團的位置有關（計算的膜厚度值見表3）。 然而，為了獲得脂質分子各個部分所在位置的準確圖片，應計算這些部分對質量密度分布的貢獻。

圖 5 質量密度分布：（a）DOPC 和 5% 的 DLin-MC3-DMA，（b）DOPE 和 5% 的 DLin-MC3-DMA，（c）DOPC 和 15% 的 DLin-MC3- DMA 和 (d) DOPE 和 15% 的 DLin-MC3-DMA。粉紅色區域顯示磷脂的 PO4 頭部基團的位置。 DLin-MC3-DMA (h) 和 DLin-MC3-DMA (t) 分別表示脂質的頭部和尾部。在表示 DLin-MC3-DMA 結構的圖像上，用于計算部分分子質量密度的部分用紅色圓圈表示。為了獲得“可比較”的輪廓，僅從頭組中取出氮和兩個碳進行計算，而從尾組中取出帶有氫的碳進行計算。從圖中磷脂的結構來看，PO4-基團被認為是脂質頭部基團的代表，而尾部則用尾部末端的CH3-基團表示。 DLin-MC3-DMA 的部分以不同的方式著色：淺灰色 - 氫，深灰色 - 碳，藍色 - 氮和紅色 - 氧。黑色虛線表示 PO4 基團質量密度的最大值點。

圖5顯示了兩種脂質的頭部和尾部對質量密度分布的貢獻。在DLin-MC3-DMA的低濃度 (5 mol%) 可以觀察到兩種磷脂的分布差異（圖 5（a）和（b））：DLin-MC3-DMA 尾部的峰位置位于DOPE頭部區域，而在DOPC的情況下，該峰出現在磷脂尾部區域。 DLin-MC3-DMA的頭部基團“更喜歡”位于 DOPC 和 DOPE 膜中的磷脂頭之間。

當DLin-MC3-DMA的量為 15 mol%（圖 5（c）和（d））時，DLin-MC3-DMA 尾部的峰移到 DOPE 頭部基團的區域外。在 DOPC 膜中，與含有 5 mol% 胺脂的脂雙層相比，該峰的位置沒有改變。此外，與含有 DOPE 的脂質雙層相比，位于 DOPC膜中心的DLin-MC3-DMA尾部數量更多。DLin-MC3-DMA的頭部“更喜歡”位于磷脂頭部的區域，但在含有 DOPC 的膜中，即使在脂雙層的中心也檢測到少量。 DLin-MC3-DMA 的這種位置與 Ramenzapour等人在模擬 DLin-KC2-DMA 以及POPC 和膽醇，處于中性 pH 值下觀察到的位置略有相似。

然而，脂質并不是模擬系統中存在的分子。由于它們的運動，水的運動會受到影響。水也可以滲透膜。在純磷脂雙層中，在雙層中心沒有檢測到大量的水，但DLin-MC3-DMA的添加改變了膜的滲透。例如，5 mol% 的量使 DOPE 脂質膜具有滲透性，而在 DOPC 的情況下，滲透性更可忽略不計。在較高濃度的 DLin-MC3-DMA (15 mol%) 情況下，情況正好相反，含有DOPC的雙層的水滲透率高于含有 5 mol% 胺脂質時的水滲透率，而對于含有 DOPE 的膜雙層中心水的質量密度幾乎為零。

這些發現表明，在 DLin-MC3-DMA 的低濃度下，脂質尾部甲基的質量密度峰值出現在 PO4 基團區域內（圖 5（b））。這種少量疏水部分的位置可能是質子轉移中斷的原因，因為在純磷脂雙層中，根據 Brändén 等人和 Yamashita 等人的說法，磷酸基團具有“質子收集效應”此外，磷脂酰堿頭部基團周圍的水分子與磷脂酰乙醇胺頭部基團周圍的水分子沒有相同的優先取向。因此，與具有 DOPC 的脂質雙層相比，外來 CH3 基團的存在更能導致 DOPE 膜中的孔形成。

在含有 DOPC 的脂質雙層中，當含有 15 mol% 時，隨著DLin-MC3-DMA濃度的增加，水滲透率略高。這與少量 DLin-MC3-DMA 的頭部基團位于由DOPC組成的膜的中心有關（圖 5（c））。這些頭部基團可以起到水分子通過膜的“轉運體”的作用。在含有等量 DLin-MC3-DMA 的DOPE的脂質雙層中，水滲透的降低可以通過 DLin-MC3-DMA 脂質尾部位置的輕微變化來解釋。DLin-MC3-DMA的甲基最大質量密度分布向 DOPE 的羰基轉移，這可以在該區域產生疏水層并防止水進入膜。

我們只能推測這些關于分子不同部分對質量密度的影響，在較高濃度的DLin-MC3-DMA下緩慢的橫向擴散可能與強相互作用有關，也可能與磷脂的頭部基團有關。特別是，在具有 DOPE脂質尾部的膜中，DLin-MC3-DMA似乎與磷脂頭部相關聯。為了闡明這一點，我們計算了兩個組分之間的徑向分布函數（RDF）。

圖 6 磷脂和 DLin-MC3-DMA 頭部基團中原子對之間的 RDF。 (a) 來自 DLin-MC3-DMA 的氧與來自 DOPC 的 CH3 基團的氫/來自 DOPE 胺基團的氫之間的 RDF。 (b) 來自 DLin-MC3-DMA 的氧與來自 DOPC/DOPE 中甘油基團的 CH2 基團的氫之間的 RDF。 部分磷脂按以下方式著色：青色-碳，藍色-氮，黃色-磷，紅色-氧，灰色-氫。 DLin-MC3-DMA 的部分以不同的方式著色：淺灰色-氫，深灰色-碳，藍色-氮和紅色-氧。

圖 7 磷脂頭部和DLin-MC3-DMA尾部原子對之間的RDF。（a）DLin-MC3-DMA中標記為“a”的碳與來自DOPC的CH3基團的氫/來自DOPE的胺基團的氫之間的RDF。 (b) DLin-MC3-DMA 中標記為“b”的碳與來自 DOPC 的 CH3 基團的氫/來自DOPE的胺基團的氫之間的 RDF。(c) DLin-MC3-DMA 中標記為“c”的碳與來自 DOPC 的CH3基團的氫/來自 DOPE 的胺基團的氫之間的 RDF。(d) DLin-MC3-DMA 中標記為“d”的碳與來自 DOPC 的 CH3 基團的氫/來自 DOPE 的胺基團的氫之間的RDF。部分磷脂按以下方式著色：青色-碳，藍色-氮，黃色-磷，紅色-氧，灰色-氫。DLin-MC3-DMA的部分以不同的方式著色：淺灰色-氫，深灰色-碳，藍色-氮和紅色-